周斌1* ，史岩2，苏鑫铭1，吴增坚1，陈溥言1

（ 1.南京农业大学农业部动物诊断与免疫开放实验室，2.勃林格殷格翰国际贸易上海有限公司） 

摘  要  根据GenBank中发表的猪伪狂犬病毒病（PRV）全基因序列病设计一对特异性引物，用PCR方法从来源于江苏省的3份PRV感染阳性病料中扩增出病毒的部分gI和gE基因。将扩增片段克隆入T载体，经氨苄青霉素（Amp）抗性筛选及EcoRI酶切鉴定，获得3个阳性重组质粒，分别命名为pT-kshPRV、pT-jrPRV、pT-njPRV。对质粒中的插入片段进行序列测定表明，所扩增的片段均长848bp，与资料报道相符。应用DNAstar序列分析软件，对测定的3个PRV流行株基因组序列与GenBank中的国内外PRV毒株进行同源性比较并绘制系统发生树，结果表明，所有PRV毒株之间核苷酸序列同源性均很高，介于97.2~100%之间；推测的氨基酸同源性介于 70.8~100%之间。江苏省内PRV流行株关系较为密切，同属一个分支；其中，昆山流行株的核苷酸与氨基酸序列与上海株100%同源；句容流行株与山东的LA株核苷酸与氨基酸同源性最高；南京流行株与湖北Ea株的核苷酸与氨基酸同源性最高。

关键词  猪伪狂犬病毒；PRV；序列分析

伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus ，PRV）属于疱疹病毒科（Herpesviridae），α疱疹病毒亚科（Alphaherpesvirinae），猪疱疹病毒Ⅰ型（Suid herpes virus Ⅰ）[2]。可引起多种家畜和野生动物出现发热、流产、死亡、奇痒及脑脊髓炎等症状[1]。基因组为线状双股DNA，核酸长度约150Kb。猪是该病毒的主要宿主及传染源。目前，该病在世界上分布广泛，并有不断蔓延扩大的趋势，已成为仅次于口蹄疫和猪瘟的危害养猪业的重要疫病[2]。 

病毒基因组由长独特区（UL）和短独特区（US），以及US两侧的末端重复序列（TR）与内部重复序列（IR）所组成。US区的方向可与UL区一致，也可以相反，从而有两种异构体。目前基因组测序已经完成，已测序列是由不同PRV毒株所测序列“拼凑”起来的。PRV只有一个血清型，基因组序列相对稳定，但分离自不同地区的毒株会有一定的差异，比较差异的程度可以为追踪流行情况提供线索。 

本试验根据公开发表的PRV全基因组序列，设计合成引物，扩增克隆了来自江苏省的3个PRV检测阳性病料的部分gI与gE基因序列，并进行测序分析，同时与Genbank中的PRV参考毒株进行同源性比较，对江苏省PRV毒株的分子流行病学及毒株来源进行了初步探讨。 

1 材料和方法 

1.1 毒株 

3个PRV检测阳性病料分别来自昆山、句容、南京，命名为kunshanPRV、jurongPRV、nanjingPRV，参考毒株序列来自GenBank。 

1.2 质粒和菌种 

pGEM-T-easy试剂盒购自Promega公司，宿主菌DH5α由本实验室保存。 

1.3 酶和试剂 

PCR试剂盒（包括rTaq酶、dNTPs、MgCl2等）、DNA分子量标准DL-2000、DL-15000、EcoRI内切酶、T4 DNA连接酶及碱性磷酸酶（CIAP）等均购自大连宝生物（TaKaRa）公司；氨苄青霉素（Amp）购自上海生工生物技术公司；DNA快速纯化回收试剂盒购自上海华舜公司。其余试剂均为分析纯。 

1.4 引物 

参照Genbank上公开发表的PRV基因组序列（登录号：BK001744）设计了以下引物： 

sense primer： 5'-ccctggacgcgaacggcacgatg-3'

antisense primer： 5'-gggtggcacgcggtctcgaagca-3'

引物由大连TaKaRa公司合成，为冻干粉，用前溶解于灭菌超纯水，稀释至浓度为20pmol/μL，-20℃分装保存备用。 

1.5 病毒DNA提取 

参照文献[3]提取PRV DNA。 

1.6 PCR扩增 

PCR反应在基因扩增仪（PE4800型，Perkin-Elmer Applied Biosystems）上进行。PCR反应体积为50μL。反应体系中含：TaKaRa公司GC buffer I 25μL，2.5 mmol/L dNTPs 8μL，上下游引物各1μL，模板10μL，rTaq酶0.5μL，用灭菌超纯水补足50μL，再加入50μL石蜡油以防止液体蒸发，然后放入PCR扩增仪中进行扩增反应。PCR扩增条件设置为：95℃变性5min后，按94℃ 1min，68℃ 1min，72℃ 1min，共进行32个循环。循环结束后，72℃延伸10min，最后置4℃保存。PCR产物在含溴化乙锭（Ethidium Bromide，EB）的1%琼脂糖凝胶上电泳，紫外光下观察PCR扩增结果。 

1.7 PCR扩增产物的克隆与序列测定 

PCR产物在1%琼脂糖电泳后，切下含有目的条带的琼脂块，用DNA快速纯化试剂盒提取凝胶中的DNA。取0.2μg的回收产物与50ng pGEM-T-easy载体连接，按萨姆布鲁克等（1992）[4]的方法转化DH5α感受态细胞。挑选菌落接种LB液体培养基，37℃摇震培养过夜。以碱裂解法小规模提取质粒。用EcoRI酶切鉴定重组质粒，阳性克隆产物送交上海博亚公司测序。 

1.8 测序分析 

应用DNAstar序列分析软件将测得的3个PRV毒株基因序列与Genbank中的序列进行同源性比较并绘制系统发生树。 

表1 本实验中引用的PRV毒株情况一览表 

Table1 PRV isolates used in this study

NCBI登录号 

毒株 

编码基因 

来源 

AF171937

Pseudorabies virus Ea

gE gene

湖北 

AF403049

Pseudorabies virus strain Fa

gE gene

广州 

AF403050

Pseudorabies virus strain Guangdong

gE gene

广东 

AY170318

Pseudorabies virus strain Min-A

gE gene

河南 

AY173125S2

Pseudorabies virus strain LA

gE gene

山东 

AY368490

Suid herpesvirus 1 strain Becker

gE gene

USA

AY683136

Suid herpesvirus 1 train SH

gE gene

上海 

 

nanjingPRV

gI-gE gene

南京 

 

jurongPRV

gI-gE gene

句容 

 

kunshanPRV

gI-gE gene

昆山 

2 结果 

2.1 PCR扩增 

PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳，紫外光下观察可见，3个PCR扩增产物中都出现了位于848bp附近一特异条带，大小与预期结果相符（图略）。 

2.2 PCR扩增产物的克隆 

将3个毒株的PCR扩增产物分别与pGEM-T-easy载体连接，并转化DH5α感受态细胞，挑取菌落，增菌培养后，小规模提取质粒。用EcoRI酶切鉴定，共获得3个含有不同PRV毒株基因扩增片段的阳性重组质粒，分别命名为pT-kshPRV、pT-jrPRV、pT-njPRV。（图略）。 

2.3 序列分析 

2.3.1 gE基因序列分析 

测序结果表明，所有3个PRV流行株包含部分gE基因长度为400bp。将这3个毒株的序列与Genbank中的其它已知参考毒株进行比较（图略）。我们主要选择来自中国的6个代表毒株，应用DNAstar分析软件对这些序列进行同源性分析发现，所有PRV毒株之间核苷酸序列同源性均很高，介于97.2~100%之间（图略）；推测的氨基酸同源性介于 70.8~100%之间（图略）。其中，昆山流行株的核苷酸与氨基酸序列与上海株100%同源；河南Min-A株和湖北Ea株的核苷酸与氨基酸序列也是100%同源。序列分析的结果提示，PRV不同流行株之间的核苷酸序列高度同源，上海株与昆山流行株很可能来源于同一祖先，但是氨基酸序列分析结果表明，这两个流行株与其余毒株有相对较大的差异。 

2.3.2  PRV毒株的遗传学关系分析

为了更好地了解PRV毒株的遗传学特性及相互的亲缘关系，我们在分析所有毒株基因组序列同源性的基础上绘制了系统发生进化树（见图1，2）。从中可以看出，国内PRV流行株主要分成两个分支，广东流行株（AF403050）与国外毒株（AY368490）关系最近，分为一支；其余流行株分为一支。江苏省内PRV流行株关系较为密切，同属一个分支。但是，利用氨基酸序列分析的结果却显示，江苏流行株中的昆山和上海株构成一个分支，而且与其余各流行株差异较大，导致该差异的主要原因是在其核苷酸序列中的一个单碱基插入造成氨基酸翻译的移码。句容流行株与山东的LA株核苷酸与氨基酸同源性最高，提示该流行株可能来自山东；南京流行株与湖北Ea株的核苷酸与氨基酸同源性最高，分别为99%和97.9%，提示该流行株与Ea株可能来自共同的祖先。 

 

图1 PRV毒株的系统发生进化树（根据核苷酸序列） 

 

图2 PRV毒株的系统发生进化树（根据氨基酸序列） 

3 讨论 

我国已有广东、海南、福建、河南、河北、湖南、湖北、江西、浙江、江苏、山东、安徽、内蒙、北京、上海、辽宁、吉林、黑龙江等至少23个省、市（包括台湾）和香港特区等发生本病[5，6]，特别是最近十年，随着我国养猪业集约化规模化的发展，猪伪狂犬病在不少地区爆发流行，有逐渐扩大和蔓延的趋势，给养猪业造成了巨大的经济损失。本研究在系统分析PRV gE基因部分序列的基础上，利用DNA病毒基因组相对稳定的特点，选取相对保守的糖蛋白E基因作为序列分析的对象，这样做的目的是为了准确体现不同流行毒株的差异，为追踪PRV的流行提供理论依据。

PRV 基因组的GC 含量高达73 % ，容易形成稳定的二级结构，妨碍Taq DNA 聚合酶在模板链上的推进，引物与模板链间存在多个非特异性结合位点而易引发非特异性扩增。这些均为PRV gE基因PCR 扩增的难点。DMSO 能有效消除模板由复杂的二级结构带来的不利影响。但DMSO 浓度过高又会影响Taq DNA酶的活性，降低扩增效率[7]。本试验采用 TAKARA公司GC buffer扩增PRV gE基因，获得了良好的扩增效果。 

PRV gE 是典型的Ⅰ型膜蛋白，N 端428 个氨基酸为胞外域，含有一个主要由疏水氨基酸组成的信号序列，C 端123 个氨基酸是亲水的胞质域，中间26 个氨基酸为疏水的跨膜域[8]。gE 基因在PRV 基因组中并不是最保守的基因，但是PRV 本身遗传变异性不大，这不仅体现在PRV 只有一个血清型，而且也体现在基因水平上。gE 基因的高同源性一定程度上也体现了PRV 基因组的保守性。 

江苏省内的3个PRV流行毒株的部分gE基因序列分析结果表明，昆山流行株的核苷酸与氨基酸序列与上海株100%同源，而上海株早在1998年已被南京农业大学传染病教研组分离鉴定，时隔近8年，在昆山得到的PRV阳性病料PCR及序列分析表明仍然与其高度同源，虽然要证明昆山流行株就是上海株还需要更多的证据，但是在其gE核苷酸序列中的一个单碱基插入却是这两个毒株特有的，而且造成氨基酸翻译的移码，从而造成遗传学特性及相互的亲缘关系分析中与其余各流行株差异较大。句容流行株与山东的LA株核苷酸与氨基酸同源性最高，提示该流行株可能来自山东；南京流行株与湖北Ea株的核苷酸与氨基酸同源性最高，分别为99%和97.9%，提示该流行株与Ea株可能来自共同的祖先。总之，通过目前的数据分析表明，江苏省内猪伪狂犬病的流行毒株来源广泛，这可能与经济发展贸易往来密切有关，但也给其的防制与根除带来困难。 

参考文献

[1] 陆承平主编.兽医微生物学[M]，第三版，北京，中国农业出版社，2001，411～483。 

[2] Thomas C Mettenleiter， PRV： the virus and molecular Pathogenesis[J]. Vet. Res. 2000（31）：99～115。 

[3] Smith，G.A，Enquist，L.W.. Construction and transposon mutagenesis in Escherichia coli of a full-length infectious clone of pseudorabies virus， an alphaherpesvirus. J.Virol.，1999，73（8）：6405～6414。 

[4] 萨姆布鲁克等著，金冬雁等译，分子克隆实验指南（第二版），中国科学技术出版社：北京. 1992。 

[5] 宋春阳，单虎，韩先杰，等，猪伪狂犬病毒血清学调查及部分特性的研究，莱阳农学院学报，2003，20（3）：217～219。 

[6]